华大DNBelab C4平台应用专题：剖析疾病致病机理 | 时空简讯22期

时空简讯第22期。

了解发病机制，是治疗疾病的关键。疾病发生发展过程是指致病因素引起的各种病理性损害与人体抗损害的反应相互“斗争”的过程。本期简讯就华大DNBelab C4平台在解析疾病病理、生命进化方面发表的8篇文章进行简述，以供参考。

病毒感染

Viral Infection

外周血细胞转录组揭示新冠肺炎和流感的免疫特征差异

Immunity [IF: 31.745]

① 利用DNBelab C4平台，对3例健康人（对照）、2例甲型流感病毒（inflfluenza A virus，IAV）感染患者和5例COVID-19患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）进行scRNA-seq，共获得46,022个单细胞，聚类为16个细胞群，描述了COVID-19患者和IVA患者PBMC的单细胞转录组图谱，并揭示了两者不同的免疫应答通路。

② COVID-19患者的PBMC样本未表达ACE2和TMPRSS2受体，且未检测到病毒序列，表明感染SARS-COV-2对PBMC中免疫细胞的组成影响很小。

③ 与健康对照组相比，COVID-19患者和IAV患者PBMC中的浆细胞水平均显著增加；与XAF1、TNF和FAS通路相关的基因上调可能导致COVID-19患者的T细胞凋亡增加。

④ 对比COVID-19患者与IAV患者的免疫分子特征，发现COVID-19患者中上调的基因主要编码促炎细胞因子、细胞因子受体和干扰素（interferon，IFN）响应的转录因子，而IAV患者中促炎转录因子和病毒相互作用宿主因子似乎高表达。（Cyto F）

试验设计与主要发现

Single-cell sequencing of peripheral mononuclear cells reveals distinct immune response landscapes of COVID-19 and influenza patients.

2020.07.19，DOI: 10.1016/j.immuni.2020.07.009

研究文章；疾病病理；人，外周血，COVID-19，甲型流感病毒，先天免疫，DNBelab C4平台，scRNA-seq; Linnan Zhu, Penghui Yang, Yingze Zhao, Zhenkun Zhuang, Zhifeng Wang, Rui Song, Jie Zhang, Fu-Sheng Wang, George F. Gao, Longqi Liu, William J. Liu；深圳华大生命科学研究院，国家传染病临床研究中心，中国疾病预防控制中心，华南理工大学；中国

华大DNBelab C4平台助力解析HIV-TB共感染中免疫障碍的机制：单核细胞有望成为HIV-TB共感染个体诊断生物标记物

Cell Insight

① 从5个HIV-1单独感染患者（HIV-pre；艾滋病未治疗）、3个HIV-1和结核杆菌（tubercle bacillus，TB）共感染且均未治疗患者（HIV-pre & TB-pre）以及3个治疗两周患者（HIV-pre & TB-pos；艾滋病未治疗，结核病治疗两周）分离PBMCs，并利用华大DNBelab C4完成scRNA-seq，首次绘制包含11种主要细胞类型、32种细胞亚型共计61,397个单细胞的HIV-TB共感染PBMCs转录图谱。

② 表征HIV-pre、HIV-pre & TB-pre和HIV-pre & TB-pos的转录组差异特征，揭示23种免疫细胞（B、T/NK、naïve T等）和9种髓细胞的变化，进一步解析HIV-1-TB共感染对循环免疫细胞的影响。

③ 证实可区分PBMCs的不同免疫细胞亚群的大量细胞标志物，包括髓细胞（FCN1、AIF1和LST1）、B细胞（BANK1、RALGPS2、TCF4和IRF8）和T细胞（IL-17R）等，并探讨其在诊断和对HIV-1-TB共感染中的保护性免疫作用。

④ 比较HIV-Pre、健康人和HIV-pre & TB-pres的单核细胞比例和功能，发现CD14 Mono（CD14⁺CD6⁺，高表达S100A9、S100A12、LYZ、PF4和PPBP），可能有助于HIV-1-TB共感染患者的结核生存。

⑤ 单核细胞亚群水平的变化具有特异性，可以区分HIV-1-TB共感染和HIV-1感染，提出单核细胞是抗结核治疗后HIV-1-TB共感染中诊断结核的有效标志物。（徐晓静）

HIV-1单独感染和HIV-1-TB共感染的外周血scRNA-seq数据集的分析流程图

Single-cell transcriptomic landscape identifies the expansion of peripheral blood monocytes as an indicator of HIV-1-TB co-infection.

2022.01.21, DOI: 10.1016/j.cellin.2022.100005

研究文章；疾病病理；人，外周血，艾滋病（HIV），结核病，单细胞转录组，HIV-1-TB共感染；Qinglong Guo, Yu Zhong, Zhifeng Wang, Tingzhi Cao, Guoliang Zhang, Liang Wu；国家感染性疾病临床医学研究中心/深圳市第三人民医院，深圳华大生命科学研究院；中国

癌症

Cancer

scRNA-seq分析PD-L1干预对TCR-T细胞疗法的影响机制

Theranostics [IF：11.556]

① 使用MART-1特异性的TCR-T细胞（TCR-T_MART-1），通过表达不同比例PD-L1、加载了MART-1_27-35多肽的MEL-526肿瘤细胞刺激，然后进行细胞检测和高通量scRNA-seq（DNBelab C4），评估肿瘤PD-L1的差异表达如何影响TCR-T细胞的功能作用，揭示了PD-L1干预的效果可能取决于高度动态和异质性免疫调节回路之间的最终平衡。

② 在表达不同比例PD-L1的肿瘤细胞刺激下，不同簇的TCR-T_MART-1表现出不同的反应，即异质性。与对照组T细胞相比，TCR-T_MART-1对衰竭更敏感，同时分泌促炎细胞因子和抗炎细胞因子，且PD-L1⁺肿瘤细胞比例增加。

③ 随着肿瘤PD-L1表达增加，趋化因子的表达谱发生改变，同时促炎和抗炎转录因子表达发生下调。

④ 肿瘤细胞和T细胞中细胞死亡信号的富集与肿瘤PD-L1表达的增加之间没有明显相关性。（Lina）

研究设计与主要发现

Single-cell transcriptome analysis of the heterogeneous effects of differential expression of tumor PD-L1 on responding TCR-T cells.

2021.03.05，DOI: 10.7150/thno.55075

研究文章；疾病病理，癌症；黑色素瘤，TCR-T，PD-L1，差异表达，DNBelab C4平台，scRNA-seq；Renpeng Ding, Shang Liu, Shanshan Wang, Cheng-Chi Chao, Qianqian Gao；深圳华大生命科学研究院，中国科学院大学；中国

多部位单细胞转录组剖析结肠直肠癌免疫浸润和转移机制

Clinical and Translational Medicine [IF：11.492]

① 采集18例原发或肝转移结肠直肠癌（colorectal cancer，CRC）患者的多个组织部位样本，包括被切除癌组织的中心（tumor center，CT) 及侵袭边缘（invasive margin，MT)、紧邻癌组织的健康组织（adjacent normal mucosa tissues，ANT）、远端组织（distinct normal tissues，DNT，距离癌组织10 cm以上），以及其中2例患者的肝转移癌组织样本（Cm）及其临近非癌组织样本（Pm），组合使用Smart-seq2（CD45⁺标记的）与DNBelab C4技术进行单细胞转录组分析，分别获得5,345个CD45⁺单细胞（Smart-seq2）和9,770个单细胞（DNBelab C4），绘制了CRC原发性和肝转移的单细胞转录图谱，为CRC的免疫浸润提供了更深入的见解。

② CRC肿瘤组织中细胞亚群的比例与对应的正常组织相比有显著差异，包括观察到了不同的T细胞免疫图谱与亚群表达模式、原发性与肝转移直肠癌具有不同的肿瘤微环境。

③ 对B细胞亚群深入分析发现，早期CRC肿瘤中的B细胞主要是具有抑制肿瘤能力的pre-B样细胞，而晚期CRC肿瘤中的B细胞则发展为浆细胞。

④ 鉴定到与CRC预后不良相关的IgA⁺IGLC2⁺浆细胞，证实了B细胞与髓样细胞信号传导通路间的显著交互，还发现了CCL8⁺ cycling B细胞与CCR5⁺ T细胞的交互可能在晚期CRC中发挥着抗肿瘤作用。

⑤ 在CRC肿瘤中，T细胞的抗肿瘤响应被激活，而在肿瘤微环境中，T细胞的抗肿瘤响应又被髓样细胞所减弱，这反映了CRC免疫系统的“激活”与“制动”机制。（郭欣雨）

研究设计流程示意图

Multiregion single-cell sequencing reveals the transcriptional landscape of the immune microenvironment of colorectal cancer.

2020.12.31，DOI: 10.1002/ctm2.253

研究文章；疾病病理，癌症；人，结肠直肠癌，肝转移，T细胞，B细胞，免疫浸润，Smart-seq2，DNBelab C4平台；Wei Wang, Yu Zhong, Zhenkun Zhuang, Jiarui Xie, Yueer Lu, Chengzhi Huang XueqingYao, Fei Ling, Zhanglin Lin, Shiping Liu；华南理工大学，深圳华大生命科学研究院；中国

单细胞多组学揭示肝癌细胞系中表型异质性对转移性潜能的影响

iScience [IF：5.458]

① 收集了5种具有不同转移性潜能的人源性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞系（HepG2、Huh7、MHCC97L、MHCC97H、SK-HEP-1细胞系），在DNBelab C系列单细胞系统上应用CITE-seq（cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing）、scATAC-seq生成单细胞转录组学（7,311个细胞）、蛋白质组和染色质可及性数据（17,736个细胞），评估了细胞系表型异质性和HCC转移潜能之间的联系，检查了上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transtion，EMT）能力、细胞增殖和低氧状态，有助于深入了解HCC的转移机制，以及加速肿瘤治疗的发展。

② 不同的HCC细胞系在基因表达水平或染色质可及状态方面表现出不同的模式，描述了6种肝癌干细胞（liver cancer stem cells，LCSC）标记物[CD24（CD24）、CD44（CD44）、CD90 （THY1）、EPCAM（EPCAM）、CD133（PROM1）、CD54（ICAM1）]在分子水平上的异质性图谱。

③ 5种HCC细胞系具有不同的上皮-间充质转化的状态，上皮-间充质转化状态与肝癌细胞系的转移性的潜能有关，其中间充质的状态与肿瘤转移正相关。

④ 鉴定一种罕见的低氧肿瘤表型（hypoxia clusters，HY clusters），具有更高的糖酵解，并表现出休眠、侵袭性的和恶性特征，这种表型能增强转移性潜能。

⑤ 根据常见的低氧基因表达特征，筛选并验证了14个基因代表这个低氧特征，可为临床研究提供预后指标，预测临床复发的可能性。（lulu）

主要发现与设计思路

Single-cell multiomics reveals heterogeneous cell states linked to metastatic potential in liver cancer cell lines.

2022.03.18，DOI: 10.1016/j.isci. 2022.103857

研究文章；疾病病理，癌症；人，肝细胞癌，上皮-间充质转化，低氧，DNBelab C系列单细胞系统，CITE-seq, scATAC-seq; Shanshan Wang, Jiarui Xie, Xuanxuan Zou, Liang Wu；中国科学院大学， 华南理工大学，深圳华大生命科学研究院；中国

睾丸胚胎性横纹肌瘤瘤内复杂性及肿瘤微环境的复杂性

Journal of Inflammation Research[IF: 4.631]

① 基于DNBelab C4平台的snRNA-seq，分析睾丸胚胎横纹肌肉瘤（embryonic rhabdomyosarcoma，ERMS）组织及邻近组织，并根据基因表达谱构建Kaplan-Meier曲线分析，确定候选标记基因与TCGA型骨肉瘤患者的总生存期和无病生存期之间的相关性，首次全面的表征了该肿瘤的瘤内异质性和肿瘤微环境，为了解睾丸ERMS的发生和发展提供了新的见解。

② 经snRNA-seq分析，从ERMS组织中共获得19,015个细胞（肿瘤细胞8,868个、邻近正常细胞10,147个），聚类分为11个类群，然后分别对肿瘤细胞、巨噬细胞和内皮细胞进行亚聚类，探索同一细胞类型内的差异，并对不同的细胞亚类进行互作分析。

③ 肿瘤细胞亚聚类分为6个肿瘤细胞簇（C1~C6），不同簇间存在着分化趋势，有不同的高表达的基因；细胞轨迹分析显示，C1亚群可能是肿瘤的起始细胞，在RMS的发展过程中转化为2种不同类型的恶性细胞C2和C5/C6。

④ 肌样细胞和肿瘤细胞比较，发现差异基因主要富集在细胞黏附和细胞外基质的通路上，表明该信号通路可能和肿瘤的进展相关；FOXM1在肌样细胞中表达下调，TCGA软组织肉瘤队列数据分析发现，高表达该基因患者的预后显著较差。

⑤细胞亚群（巨噬细胞和肿瘤细胞、内皮细胞和肿瘤细胞）之间的相互作用分析表明，胶原相关基因COL6A1从ERMS的发生到整个恶性发展过程中起重要作用。（孙楚雯）

注：睾丸胚胎性横纹肌瘤是一种具有高度异质性的罕见肿瘤，常认为起源于肌样细胞（myoid cells）。

睾丸胚胎横纹肌肉瘤样本的scRNA-seq工作流程

Single nuclear RNA sequencing highlights intra-tumoral heterogeneity and tumor microenvironment complexity in testicular embryonic rhabdomyosarcoma.

2022.01.22，DOI：10.2147/JIR.S343068. eCollection 2022

研究文章；疾病病理，癌症；胚胎性横纹肌肉瘤，肿瘤异质性，细胞外基质，肿瘤微环境,snRNA-seq，DNBelab C4平台；Xuezheng Xu, Zhizhong Liu, Yanwei Luo, Hao Bo；湖南肿瘤医院，中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院，湖南省湘雅生殖遗传临床研究中心，湘雅生殖遗传医院，中南大学生殖和干细胞工程研究所，中国

生命进化

Life Evolution

scRNA-seq和scATAC-seq揭示灵长类神经节隆起进化保守性与非保守性的发育特征及调控网络

Cell Research [IF: 25.617]

① 选用胚胎发育早期的食蟹猴和人类胎儿样本（孕周为9、13周），利用scRNA-seq和scATAC-seq对人类（13,782个细胞）及食蟹猴（29,269个细胞）神经节隆起（ganglionic eminences，GEs）的基因表达特征进行了描述，揭示了在胚胎发育早期GEs的细胞多样性以及发育轨迹；通过与小鼠的跨物种比较，确定了灵长类GEs中外侧放射状胶质细胞（radial glia cells，RGCs）的存在，并利用建立的人类神经节隆起发育的调控网络，找到了人类特异性基因及其相关的新调控通路。

② 通过scRNA-seq和scATAC-seq检测，混合物种测序结果进行整合分析，发现人类和食蟹猴的GE细胞无显著细胞类型差异；轨迹推断显示，其由GEs祖细胞起源，增殖生成中间祖细胞（intermediate progenitors，IPCs），然后在外侧神经节隆起（latera GE，LGE）、内侧神经节隆起（media GE，MGE）和尾侧神经节隆起（cauda GE，CGE）中分化成不同的谱系。

③ 对神经祖细胞亚群进行重新聚类分析，鉴定出RGC和IPC，NKX2-1、PAX6和NR2F2分别代表RGC中的MGE、LGE和CGE祖细胞；通过免疫荧光可在人、食蟹猴而非小鼠的脑室区、脑室下区发现外侧RGCs。此外，发现了与增殖相关的人、猴、鼠之间的RGC差异基因细胞，RGS16基因在IPC细胞有丝分裂后期特异性表达，且受PAX6、GLI3、HES5等增殖相关基因调控。

④ 对MGE细胞进行重分群和轨迹重建，鉴定出4种不同的细胞类型，所有较成熟的细胞均有细胞粘附和轴突投射有关的基因表达；MGE中的细胞分化较早，细胞系的多样化具有时间依赖性；几乎所有CGE细胞都高表达NR2F1和NR2F2基因，灵长类的CGE细胞中CCK⁺和CALB2⁺或许较RELN⁺和VIP⁺中间神经元更早特化。

⑤ 在GE发育过程中，一组来自MGE的LHX8⁺中间神经元沿着LGE迁移，并受到SEMA3A-NRP1信号通路和MIR7-3HG-PEG10通路的调控，结合拟时序分析构建了LGE区域的遗传调控模型。

⑥ 提出了MIR9-1HG受ASCL1和TCF4调控的新通路；hsa-mir-9-1可以抑制ZFHX4和ID4的表达，或可解释MGE和LGE在人类早期大脑发育过程中的不同命运。（舟江海）

胚胎样本采集及scRNA-seq流程示意图

Evolutionarily conservative and non-conservative regulatory networks during primate interneuron development revealed by single-cell RNA and ATAC sequencing.

2022.03.10，DOI：10.1038/s41422-022-00635-9

研究文章；脑及神经科学，生命进化；人，食蟹猴，大脑，神经节隆起，生物信息学，scRNA-seq，scATAC-seq；Ziqi Zhao, Dan Zhang, Fuqiang Yang,Yaqing Wang,  Zhiheng Xu；中国科学院遗传与发育生物学研究所，中国科学院大学，深圳华大生命科学研究院；中国

DNBelab C4平台探索中国舌鳎卵发生机制和脊椎动物生殖系统的进化

Frontiers in Cell and Developmental Biology [IF: 6.684]

① 收集6只10月龄的性成熟中国舌鳎（Cynoglossus semilaevis）卵巢，在华大自主开发的DNBelab C4平台完成scRNA-seq，绘制包含8种卵巢细胞类型、共7,185个单细胞的舌鳎卵巢单细胞图谱，为单细胞分辨率下鱼类卵发生的细胞类型特异性机制提供新见解。

② 多能性、有丝分裂和减数分裂等相关基因在卵原、卵母细胞之间的动态表达，表征出早期卵原细胞、有丝分裂卵原细胞和卵母细胞3种生殖细胞的连续发育，发现arid3a、znf407和zeb1等影响生殖细胞发育的转录因子。

③ 对卵泡细胞进行重聚类并确定卵泡壁的细胞组成，发现4个不同的颗粒细胞和1个膜细胞亚型，突破了对鱼卵泡双层卵泡细胞的已有见解，表明卵泡细胞在鱼类卵发生中的独特作用。

④ 生殖细胞与颗粒细胞之间存在双向交流，而生殖细胞与膜细胞之间仅存在从膜细胞到生殖细胞的单向调控，提出广泛的生态位-生殖系双向交流调节着鱼类的卵发生，揭示两种常见的卵发生相关信号通路（TGF-β和NOTCH）的表达模式，并通过排卵相关基因的表达模式揭示了鱼类排卵基于不同颗粒细胞和膜细胞的协同作用。

⑤ 对舌鳎和猕猴同源基因的系统生物学分析，发现卵发生相关同源基因zar1、sall4和ybx2等具有相似表达模式，提示它们在卵发生中的同源功能，证明鱼类和哺乳动物的卵发生具有进化保守机制。（徐晓静）

中国舌鳎卵巢细胞scRNA-seq数据的分析流程图及单细胞图谱

Single-cell atlas of the Chinese Tongue Sole (Cynoglossus semilaevis) ovary reveals transcriptional programs of oogenesis in fish.

2022.03.01, DOI：10.3389/fcell.2022.828124

研究文章；生命结构，生命进化；中国舌鳎，卵巢，生殖细胞，卵子发生，DNBelab C4平台，scRNA-seq，系统生物学；Xiang Liu，Yingyi Huang，Guangyi Fan，Changwei Shao；上海海洋大学，深圳华大生命科学研究院，中国水产科学研究院；中国

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